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Cryopréservation, Distribution, Typage et Archivage animal (CDTA)

Cryoconservation



Le service CRYOCONSERVATION préserve plus de 1000 lignées de souris sous forme d´embryons et sous forme de sperme. Il assure ainsi leur pérennité au bénéfice de l´inventeur et de l´ensemble de la communauté scientifique.

Les embryons sont obtenus selon deux méthodes :

  • In vivo : les embryons sont récupérés par flushing des oviductes sous loupe binoculaire, suite à l´accouplement contrôlé de femelles pré pubères super ovulées avec des mâles fertiles de 8 semaines minimum. Les embryons sont récoltés à différents stades : 2 cellules, 4-8 cellules et morula/blastocyste.
  • par fécondation in vitro (FIV) : elle permet l´obtention d´embryons au stade 2 cellules, aussi bien à partir de sperme frais que de sperme congelé. Pour cela, des ovocytes obtenus après super ovulation de jeunes souris femelles sont mis en contact avec des spermatozoïdes pendant 6 heures à l´étuve. Les ovocytes fécondés sont ensuite triés puis laissés à nouveau à l´étuve jusqu´au lendemain matin, jour du stade 2 cellules.

Quel que soit leurs origines (in vivo ou in vitro), les embryons obtenus sont sélectionnés sous microscope puis introduits dans des paillettes en présence de cryoprotecteur (1-2 propane diol), et congelés selon le protocole publié par protocole publié par Renard et Babinet en 1984 . Il s´agit d´une congélation lente où le refroidissement se fait par pallier et progressivement jusqu´à une température de -140°C. Les embryons sont alors plongés dans l´azote à -196°C et maintenus soit en azote liquide, soit en azote gazeux. Par sécurité, l´archivage est réalisé dans deux lieux distincts.

Pour chaque lignée congelée sous forme d´embryons, un test de viabilité est réalisé : une paillette d´une vingtaine d´embryons est sélectionnée aléatoirement et décongelée. Le nombre d´embryons viables obtenus par rapport au nombre total d´embryons décongelés correspond au taux de survie. Les embryons viables sont ensuite transférés dans l´infundibulum d´une femelle pseudo gestante (femelle accouplée avec un mâle vasectomisé et physiologiquement apte à la nidation). Le nombre de petits nés par rapport au nombre d´embryons transférés nous permet de calculer le taux de viabilité de la lignée.

La prestation de congélation de sperme est également proposée pour la plupart des fonds génétiques notamment les fonds C57BL/6. Le cryoprotecteur utilisé est soit CPA-MTG soit CPA-FertiupTM.

Pour chaque lignée congelée sous forme de sperme, la quantité et la qualité du sperme sont évaluées de visu. Le sperme d´un mâle permet de congeler 10 paillettes et nous congelons le sperme de 4 à 5 mâles par lignée. Afin d´évaluer la viabilité mais aussi la fertilité du sperme congelé, une paillette de sperme est décongelée de façon aléatoire avant de réaliser une FIV. Le nombre d´embryons obtenus par rapport au nombre total d´ovocytes récoltés nous donne le taux de fécondation.

Les paillettes d´embryons et de sperme sont accessibles uniquement aux chercheurs propriétaires de la lignée, dans la cadre des prestations CDTA, ou à l´ensemble de la communauté scientifique dans le cadre du programme EMMA (European Mouse Mutant Archive).


Prestations

Cryoconservation simple

Cryoconservation dans le cadre d'EMMA


Pascal MAUNY    e-mail

Responsable du service
Responsable cryoconservation EMMA au TAAM

Tél: 02 38 25 54 53
Fax: 02 38 25 54 46